N-乙酰半胱氨酸对TGF-β1诱导的ARPE-19细胞向肌成纤维细胞转分化的影响

摘要：背景 视网膜色素上皮(RPE)细胞转分化为肌成纤维细胞是增生性玻璃体视网膜病变发生和发展中的一个核心事件.N-乙酰半胱氨酸(NAC)能够通过抑制转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的细胞内活性氧(ROS)的产生和MAPK蛋白的磷酸化来抑制多种细胞向肌成纤维细胞的转分化,但是NAC对TGF-β1诱导的人RPE细胞系ARPE-19细胞向肌成纤维细胞转分化的影响及其潜在的分子机制尚不清楚. 目的 研究NAC对TGF-β1诱导的ARPE-19细胞向肌成纤维细胞转分化的影响及其潜在的分子机制.方法 体外培养人ARPE-19细胞并分为对照组、TGF-β1处理组、NAC干预组和NAC单独处理组,对照组不做处理,其他3个组分别使用10 ng/ml TGF-β1、10 ng/ml TGF-β1 +5 mmol/L NAC和5 mmol/L NAC处理细胞48 h,相差显微镜下观察细胞的形态学改变.采用实时荧光定量PCR、Western blot、免疫荧光及ELISA法检测转分化标志基因α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、纤维结合蛋白及Ⅰ型胶原的表达情况.使用非荧光探针DCFH-DA通过流式细胞仪检测在TGF-β1处理后1h,细胞内ROS的产生情况及NAC对细胞内ROS产生的影响.采用Western blot法检测各组细胞内p38MAPK、ERK1/2及SAPK/JNK蛋白磷酸化的影响.采用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)法检测不同浓度NAC对ARPE-19细胞生存的影响. 结果 实时荧光定量PCR、Western blot及ELISA实验结果表明,与对照组相比,TGF-β1处理组α-SMA、纤维结合蛋白和Ⅰ型胶原mRNA表达水平均上调,分别是对照组的(2.15±0.29)、(9.54±1.08)和(25.78±0.66)倍,蛋白表达水平分别是对照组的(8.49±0.32)、(2.53±0.69)和(4.45±1.05)倍,差异均有统计学意义(均P＜0.05).NAC干预组α-SMA、纤维结合蛋白和Ⅰ型胶原mRNA的表达水平分别是TGF-β1处理组的(66.70±12.57)％、(66.11±8.35)％和(33.19±6.90)％,蛋白表达水平分别是TGF-β1处理组的(52.30±4.83)％、(55.03±2.58)％和(56.08±3.65)％,差异均有统计学意义(均P＜0.05).流式细胞仪分析结果显示,TGF-β1处理组细胞内ROS的产生水平较对照组增加,是对照组的(2.12±0.20)倍,NAC干预组细胞内ROS水平是TGF-β1处理组的(57.41±9.45)％,差异均有统计学意义(均P＜0.01).Western blot结果显示,与对照组相比,TGF-β1处理组p38MAPK、SAPK/JNK及ERK1/2蛋白磷酸化水平均上调,分别是对照组的(9.18±1.00)、(4.87±0.81)和(4.20±0.69)倍,差异均有统计学意义(均P＜0.05).使用NAC干预处理后,p38MAPK、SAPK/JNK及ERK1/2蛋白磷酸化水平分别是TGF-β1处理组的(48.16±14.82)％、(67.90±2.90)％和(74.52±4.00)％,差异均有统计学意义(均P＜0.05). 结论 NAC可能通过抑制TGF-β1诱导的ROS的产生及p38MAPK、SAPK/JNK及ERK1/2蛋白的磷酸化进而抑制ARPE-19细胞向肌成纤维细胞转分化.