期刊简介
中国科学技术协会主管，中华医学会主办。本刊原《眼科研究》，是中国科技论文统计源期刊和中文核心期刊。本刊关注国内外实验眼科学发展动态，传播眼科基础研究重大进展，报道眼科实验研究成果及其临床应用，读者对象为高等院校、科研单位和临床眼科工作者。本刊国内发行于包括港、澳、台在内的我国各省份和地区，国外发行在东南亚、北美、西欧等地区的部分国家。本刊期待刊出高质量的研究成果，以飨读者。
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首页>中华实验眼科杂志
- 杂志名称：中华实验眼科杂志
- 主管单位：中国科学技术协会
- 主办单位：中华医学会
- 国际刊号：2095-0160
- 国内刊号：11-5989/R
- 出版周期：月刊
期刊荣誉：中国中文核心期刊期刊收录：北大核心期刊(中国人文社会科学核心期刊), 万方收录(中), 知网收录(中), 医学文摘, 哥白尼索引(波兰), 维普收录(中), 国家图书馆馆藏, JST 日本科学技术振兴机构数据库(日), CSCD 中国科学引文数据库来源期刊(含扩展版), 上海图书馆馆藏, CA 化学文摘(美)
Smac siRNA慢病毒载体的构建及其对Smac基因沉默效果的鉴定
李云；郑广瑛；蒋瑜
关键词：线粒体蛋白, 凋亡, 小干扰RNA, 基因载体, 慢病毒载体/基因, 基因转染技术, 人, 晶状体上皮细胞
摘要：背景 研究证实半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶激活剂(Smac)蛋白是肿瘤细胞的促凋亡蛋白,我们先前的研究表明,Smac蛋白在白内障患者LECs中表达量明显高于正常人,因此推测沉默LECs中Smac的表达可抑制LECs的过度凋亡,但如何成功将Smac siRNA转染进入LECs是研究的关键. 目的 构建人Smac siRNA慢病毒载体并对人LECs进行感染,研究慢病毒载体构建方法及其在人晶状体上皮细胞HLE-B3中的干扰效率,利用RNA干扰(RNAi)技术建立Smac低表达的HLE-B3株. 方法 根据我们前期的工作设计并合成针对Smac基因序列的siRNA序列,将合成的双链DNA以T4噬菌体DNA连接酶与GV118慢病毒载体相连接,转化DH5α感受态细胞,采用PCR筛选阳性克隆,经测序鉴定正确后,感染293T细胞,收集上清液并标定病毒滴度.用重组慢病毒感染HLE-B3细胞,荧光显微镜下观察转染后的阳性HLE-B3细胞数并计算病毒感染复数(MOI).将常规培养的HLE-B3细胞分为阴性对照组、空质粒组和GV 118-Smac-siRNA1组,阴性对照组为常规培养的细胞,空质粒组细胞仅转染不含慢病毒载体的siRNA质粒,GV118-Smac-siRNA1组细胞转染GV118-Smac-siRNA1质粒,采用实时荧光定量PCR检测各组细胞中Smac mRNA的相对表达量. 结果 构建的重组载体GV118-Smac-siRNA1转化DH5α感受态细胞后阳性克隆产物大小为340 bp,空载的克隆产物为299 bp,与预期结果相符,测序结果显示合成的Smac-siRNA1与预期目的序列一致.构建的GV118-Smac-siRNA1病毒滴度为3.0×108 TU/ml.感染HLE-B3细胞后荧光显微镜下可见MOI为100时,细胞毒性低且感染效率高,约为82％.阴性对照组、空载质粒组和GV118-Smac-siRNA1质粒组细胞中Smac mRNA相对表达量分别为(101.290±8.349)％、(92.330±6.320)％和(32.540±4.221)％,3个组间总体比较差异有统计学意义(F=32.871,P＜0.01),其中GV118-Smac-siRNA1质粒组细胞中Smac mRNA相对表达量较阴性对照组明显下降,差异有统计学意义(P=0.000),而空载质粒组细胞中Smac mRNA相对表达量略低于阴性对照组,但组间差异无统计学意义(P=0.535). 结论 本研究中成功构建了siRNA慢病毒载体GV118-Smac-siRNA1,其转染HLE-B3效率高,该siRNA载体能够有效地抑制人LECs中Smac基因的表达.
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