Notch信号对激光诱导的小鼠CNV生成过程中巨噬细胞极化表型及功能的调控

摘要：背景 巨噬细胞在脉络膜新生血管(CNV)中的作用尚存在争议,与其在不同微环境中的功能异质性有关,Notch信号通路参与眼内新生血管生长的调控,但其对CNV中巨噬细胞功能的调控作用尚未证实. 目的 探讨巨噬细胞在CNV生成中极化表型的变化与Notch信号通路对巨噬细胞极化表型的调控.方法 在体实验选择58只成年雄性C57BL小鼠,以随机数字表法按照造模后取材时间的不同随机分为光凝后3d组和7d组.每组选23只小鼠用视网膜光凝法诱导小鼠CNV模型,分别于光凝后3d和7d制备脉络膜铺片,采用免疫荧光染色法观察CNV面积和巨噬细胞阳性染色面积,血管内皮生长因子(VEGF)及肿瘤坏死因子α(TNF-α)的分泌情况;光凝后3d和7d对眼杯冰冻切片行免疫荧光染色,观察CNV中巨噬细胞的极化表型及其分泌VEGF、TNF-α的情况,评估巨噬细胞上Notch信号胞内段(NICD)相应分子标志物的表达情况.每组设定6只小鼠的左眼为正常对照眼,其右眼以激光光凝法建立CNV模型,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测眼杯组织中VEGF、TNF-α和巨噬细胞极化相关因子的表达情况.体外分离和培养C57BL小鼠的骨髓单核前体细胞,用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)诱导其分化为巨噬细胞,加入Notch信号通路抑制剂γ-分泌酶抑制剂(GSI)和极化诱导因子,24 h后收集细胞及培养液上清,通过qRT-PCR及ELISA法检测M1型、M2型巨噬细胞分子表面标志物的表达水平. 结果 与光凝后第3天比较,光凝后第7天CNV面积明显增大,但巨噬细胞浸润面积缩小,差异均有统计学意义(t=8.138、5.272,均P=0.000).光凝后第3天,巨噬细胞在CNV周边和中央均有分布,第7天时局限于CNV中央部.光凝后第3天,色素上皮-脉络膜-巩膜复合体中精氨酸合酶1(Arg1)、甘露糖受体(MR)及白细胞介素-6(IL-6)mRNA的相对表达量明显高于第7天,而诱导型一氧化氮合酶(iNOS) mRNA的相对表达量无明显改变.免疫荧光结果显示,光凝后第3天F4/80+ Arg1+细胞(M2型巨噬细胞)数量明显多于F4/80+ iNOS+细胞(M1型巨噬细胞),光凝后第7天F4/80+ Arg1+细胞数量明显减少,差异均有统计学意义(t=7.348,P=0.000;t5.562,P＜0.001),但仍多于F4/80+ iNOS+细胞,二者间差异有统计学意义(t=4.568,P＜0.01).在光凝后3d时巨噬细胞分泌的VEGF和TNF-α明显多于光凝后7d,差异均有统计学意义(t=5.143、4.519,均P＜0.01).巨噬细胞中Notch信号下游分子在光凝后3d时未见表达,7d时表达量明显增加,差异均有统计学意义(均P＜0.05).体外实验表明,阻断Notch信号后,M1型巨噬细胞分子标志物表达量明显下降,而M2型巨噬细胞分子标志物的表达量明显增加,差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论 巨噬细胞的极化表型在CNV模型的不同阶段发生变化,而巨噬细胞中Notch信号的激活状态调控巨噬细胞的极化表型改变和功能.