银杏叶提取物对体外培养的人Müller细胞氧化损伤的保护作用

摘要：背景 氧化应激是视网膜损伤中重要的病理生理过程,探讨保护视网膜免受氧化应激损伤的方法具有重要的临床意义.研究证实银杏叶提取物具有抗氧化、抗凋亡、抗血栓、抗炎等多种功能,但其对人Müller细胞的抗氧化作用研究较少. 目的 研究银杏叶提取物(EGb)对氧化剂三氧化二砷(As2O3)诱导的人Müller细胞氧化应激损伤的保护作用及其机制. 方法 人Müller细胞株用含体积分数10％胎牛血清(FBS)、2μmol/L谷氨酰胺和质量分数1％青链霉素双抗的DMEM/F12培养液进行培养和传代,取对数生长期的Müller细胞分为5个组,阴性对照组细胞采用常规培养法进行培养,在培养基中加入终质量浓度为5 mg/L的As2 O3处理细胞24 h以建立细胞氧化损伤模型,然后将5、10和20 mg/L EGb分别加入模型细胞培养液中作用24 h,采用MTT法检测各组细胞的活力;采用CM-H2DCFDA荧光探针法测定各组细胞活性氧簇(ROS)含量;采用逆转录PCR(RT-PCR)法检测细胞中easpase-3 mRNA的相对表达量;采用Western blot法分别检测细胞质和细胞核中Nrf2蛋白的表达. 结果 Müller细胞接种至培养瓶后24 h,倒置显微镜下可见接种细胞贴壁良好,培养6～7d时Müller细胞的细胞体积较大,细胞质丰富,呈镶嵌样排列.As2O3处理组部分细胞凋亡,呈卵圆形悬浮在培养液中.MTT法测定结果表明,阴性对照组细胞活力(A值)高,As2 O3处理组细胞活力低,而As2O3 +5 mg/L EGb组、As2O3+10 mg/L EGb组和As2O3+20 mg/L EGb组A值随着EGb质量浓度的增加而逐渐增加,各组间总体比较差异有统计学意义(F=163.57,P=0.00).阴性对照组细胞中ROS荧光强度弱,As2O3处理组强,As2O3 +5 mg/L EGb组、As2O3+10 mg/L EGb组和As2 O3 +20 mg/L EGb组细胞中ROS荧光强度值随着EGb质量浓度的升高而逐渐减弱,各组间细胞中ROS荧光强度值的总体比较差异有统计学意义(F=4 013.61,P=0.00).细胞内caspase-3 mRNA的相对表达量随EGb质量浓度的升高逐渐下降,各组间总体比较差异有统计学意义(F=2 199.72,P=0.00).各组细胞质中Nrf2蛋白的表达比较,差异无统计学意义(F=15.42,P=0.40);阴性对照组、As2O3处理组及As2O3+5 mg/L EGb组、As2O3+ 10 mg/L EGb组和As2 O3 +20 mg/L EGb组细胞核Nrf2蛋白表达量(灰度值)分别为100.01±0.04、46.59±0.63、54.51 ±0.62、59.93±0.17和67.60±0.24,总体比较差异有统计学意义(F=7271.72,P=0.00),其中阴性对照组细胞核Nrf2蛋白表达量低,而As2O3处理组高,差异均有统计学意义(均P＜0.05). 结论 EGb以剂量依赖的方式减轻体外培养的人Müller细胞的氧化应激损伤,其机制与抗氧化和抗凋亡作用有关,其减轻Müller细胞氧化应激损伤的调控主要发生在细胞核.