补肾活血中药血清对缺氧条件下纯化培养视网膜神经节细胞的保护作用及其机制

摘要：背景 糖尿病视网膜病变(DR)的早期损害是高糖和缺氧导致的视网膜神经细胞的结构和功能性损伤.研究表明含补肾活血中药的血清能减轻缺氧和高糖状态下神经兴奋性毒性物质谷氨酸的毒性作用,但是否可提高神经兴奋抑制性物质甘氨酸的释放,从而对视网膜神经细胞发挥保护作用尚不清楚. 目的 探讨补肾活血中药血清对体外缺氧条件下纯化培养的视网膜神经节细胞(RGCs)的保护作用. 方法 采用中药或生理盐水对SD大鼠每日灌胃1次,7d后腹主动脉取血离心过滤提取正常大鼠血清和含补肾活血中药的大鼠血清.体外两步法纯化培养SD乳鼠的RGCs,用免疫荧光染色法对培养的RGCs进行鉴定.将RGCs置于96孔培养板中培养72 h后分为正常对照组(20％正常SD大鼠血清培养)、缺氧组(1.0 mmol/L连二亚硫酸钠培养)、正常中药干预组(20％ SD大鼠含药血清培养)、缺氧中药干预组(1.0 mmol/L连二亚硫酸钠+20％SD大鼠含药血清干预).于培养后24、48、72 h用L-8800型全自动氨基酸分析仪测定各组细胞外液中谷氨酸及甘氨酸的质量浓度,用乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒测定各组细胞培养上清液LDH的漏出量.结果 培养的细胞荧光染色阳性.细胞培养24 h,正常对照组谷氨酸、甘氨酸质量浓度和LDH的含量分别为(0.080 5±0.001 0)mg/L、(0.055 4±0.001 5) mg/L及(1 626.03±122.10) μmol/(min·L),而缺氧组为(0.022 5±0.001 1)mg/L、(0.014 6±0.001 1)mg/L及(1 458.68±94.23) μmol/(min·L),均明显低于正常对照组,差异均有统计学意义(q=-3.53,P=0.00；q=-2.45,P=0.00；q=-2.98,P=0.02).细胞培养48 h,缺氧组的LDH含量及甘氨酸质量浓度均明显高于正常对照组,差异均有统计学意义(q=2.55,P=0.01；q=4.48,P=0.00)；细胞培养72 h,缺氧组谷氨酸和甘氨酸质量浓度均明显高于正常对照组,差异均有统计学意义(q=2.45,P=0.00；q=3.72,P=0.00).细胞培养48 h、72 h,缺氧中药干预组甘氨酸质量浓度为(0.017 4±0.001 5) mg/L和(0.019 2±0.001 2) mg/L,明显高于缺氧组的(0.016 0±0.001 2)mg/L和(0.018 0±0.000 8) mg/L,差异均有统计学意义(q=2.28,P=0.04；q=2.33,P=0.03).缺氧中药干预组的LDH含量分别为(1 632.94±264.31) μmol/(min·L)和(1 875.00±137.45)μmol/(min·L),明显低于缺氧组的(1 688.49±112.86)μmol/(min · L)和(2 267.86±175.21) μmol/(min·L),差异均有统计学意义(q=-2.95,P=0.02；q=-2.35,P=0.00)；细胞培养24、48和72 h,缺氧中药干预组和缺氧组谷氨酸质量浓度的差异均无统计学意义(P=0.55、0.28、0.46).RGCs中谷氨酸与甘氨酸质量浓度均呈正相关(Kendall、Spearman相关系数分别为0.519和0.696,均P=0.000).结论 缺氧条件下RGCs中谷氨酸与甘氨酸释放量同步增加,可能是细胞对短期缺氧的自身代偿性反应.补肾活血中药能增强缺氧条件下RGCs中甘氨酸的释放,减少LDH的漏出,从而保护RGCs.