Krüppel样因子6抑制人晶状体上皮细胞增生的研究

摘要：背景 研究表明,Krüppel样因子6(KLF6)与生长发育、细胞分化、增生、凋亡、血管生成及组织修复等生理或病理过程有关.在眼科领域,关于人晶状体上皮细胞(LECs)中KLF6蛋白表达水平及KLF6对LECs增生的影响报道较少. 目的 探讨KLF6对LECs株(HLE-B3)增生的抑制作用. 方法 首先用逆转录PCR(RT-PCR)法构建真核表达质粒pEGFP-C2-KLF6,并用双酶切法和PCR法对表达质粒进行鉴定.用含体积分数10％胎牛血清的低糖DMEM对HLE-B3进行培养和传代,按照干预方法的不同将培养的HLE-B3分成4个组,各组均给予KLE-B3转染试剂,空白对照组不加入任何外源质粒及胰岛素样生长因子-1(IGF-1);单纯IGF-1刺激组仅给予IGF-1刺激;空质粒转染+IGF-1组加入pEGFP-C2质粒空载体,同时给予IGF-1刺激;pEGFP-C2-KLF6转染+IGF-1组加入pEGFP-C2-KLF6真核表达质粒,且给予IGF-1刺激.细胞干预24 h后,采用水溶性四唑盐-1(WST-1)实验检测各组细胞的吸光度(A450)值;采用Western blot法测定各组细胞中KLF6蛋白的表达水平.以1×104个/片的密度将HLE-B3细胞爬片培养24 h,并分别将0、0.10、0.25 μg pEGFP-C2-KLF6转染到各组铺片细胞中,用终质量浓度为50 μg/L的IGF-1刺激24 h,然后应用免疫细胞化学技术检测各组细胞中Ki-67蛋白的相对表达量;采用荧光半定量PCR法检测各组细胞中Ki-67 mRNA的表达变化.结果 扩增得到的PCR产物反应条带与KLF-6基因长度相符,PCR和EcoR I、Sal I限制性内切酶双酶切法鉴定条带大小与预期相符,成功构建pEGFP-C2-KLF6真核表达质粒.WST-1实验显示空白对照组、单纯IGF-1刺激组、空质粒转染+IGF-1组和pEGFP-C2-KLF6转染+IGF-1组细胞A值分别为0.86±0.00、2.10±0.01、2.24±0.12和1.06±0.02,4个组间差异有统计学意义(F=38.322,P＜0.05),其中pEGFP-C2-KLF6转染+IGF-1组A值明显低于单纯IGF-1刺激组和空质粒转染+IGF-1组,差异均有统计学意义(q=6.42、7.31,P＜0.05).Western blot法检测显示,4个组间细胞中KLF6蛋白相对表达量的差异有统计学意义(F=591.858,P＜0.05),pEGFP-C2-KLF6转染+IGF-1组KLF6蛋白相对表达量分别是空白对照组、单纯IGF-1刺激组和空质粒转染+IGF-1组的1.47、2.04、3.27倍.Ki-67蛋白在pEGFP-C2-KLF6转染+IGF-1组细胞中的表达强度随质粒转染剂量的增加而逐渐减弱,0.10 μg和0.25 μg pEGFP-C2-KLF6转染后细胞中Ki-67 mRNA相对表达值分别为0.15±0.08和0.11±0.03,明显低于0μg pEGFP-C2-KLF6转染的细胞0.77±0.12,组间的总体差异有统计学意义(F=54.825,P＜0.05). 结论 KLF-6能够抑制IGF-1诱导的HLE-B3的增生,是HLE-B3细胞增生的调控因子.