血管内皮生长因子小干扰RNA对氧诱导视网膜病变中视网膜新生血管的抑制作用

摘要：背景 特异性地抑制视网膜中血管内皮生长因子(VEGF)的过度表达,有望成为有效抑制新生血管的方法.RNA干扰(RNAi)可高效、特异地抑制体内特定基因的表达,眼局部应用小干扰RNA(siRNA)对身体其他组织基因的干扰小.目的 探讨在小鼠氧诱导视网膜病变(OIR)模型中VEGF的siRNA对视网膜中VEGF和新生血管的抑制作用.方法 设计并体外合成表达VEGFsiRNA的质粒[psi-HITM/增强型绿色荧光蛋白(EGFP)/VEGF siRNA].小鼠血管瘤内皮(EOMA)细胞在不含抗生素的DMEM培养液中进行培养,细胞融合达70％时分为5个组:空白对照组培养孔培养基中无任何添加物,阴性对照组培养孔板内加入1 μl LipofectamineTM2000和空质粒psi-HITM/EGFP,3个siRNA组中分别在培养孔板内加入1μlLipofectamineTM2000+40、50、60 nmol/L质粒psi-HITM/EGFP/VEGF siRNA.分别利用实时定量PCR(real-time PCR)和Western blot法检测EOMA细胞中VEGF mRNA和蛋白的表达,以筛选佳干扰效率的VEGF siRNA浓度.64只出生7d的C57BL/6J小鼠采用随机数字表法随机分为正常对照组(在正常氧环境中喂养)、模型对照组(不进行玻璃体腔内注射)、空质粒组和siRNA组,其中后3个组小鼠在氧体积分数(75±2)％的氧箱内饲养5d,然后置于正常氧环境中制备OIR动物模型.空质粒组和siRNA组于出生后12 d(P12)小鼠玻璃体腔内分别注射psi-HITM/EGFP和LipofectamineTM2000各0.5 μl混合物及psi-HITM/EGFP/VEGF siRNA(60 nmol/L)和LipofectamineTM 2000各0.5μl混合物,各组P17小鼠经高相对分子质量荧光素(FITC-dextran)灌注后制备视网膜铺片、视网膜切片和视网膜标本,分别观察视网膜新生血管的变化及突破内界膜新生血管内皮细胞数,应用real-time PCR和Western blot法检测视网膜中VEGF mRNA及其蛋白的表达.结果 体外细胞转染实验表明,空白对照组、阴性对照组及40、50、60 nmol/L siRNA转染组EOMA细胞中VEGF mRNA和蛋白表达的总体比较差异均有统计学意义(F=148.890,P＜0.001；F=306.960,P＜0.001),各浓度siRNA组细胞中VEGF mRNA表达均明显低于空白对照组,差异均有统计学意义(t＝73.950、119.890、156.480,均P＜0.001).各浓度siRNA组细胞中VEGF蛋白的表达明显低于空白对照组,差异均有统计学意义(t=15.452、23.344、42.119,均P＜0.001),以60 nmol/L siRNA组作用强.动物实验结果表明,与模型对照组和空质粒组比较,siRNA组小鼠视网膜无灌注区和新生血管丛明显减少,突破内界膜血管内皮细胞的细胞核数减少.正常对照组、模型对照组、空质粒组和siRNA组小鼠视网膜中VEGF mRNA的相对表达量分别为1.23±0.18、4.02±0.16、3.98±0.19、1.98±0.12,总体差异有统计学意义(F=369.780,P＜0.001),其中模型对照组和空质粒组VEGF mRNA表达明显高于正常对照组,差异均有统计学意义(t=37.880、37.336,P＜0.001),而siRNA组小鼠视网膜VEGF mRNA的表达较正常对照组下降50.8％,差异有统计学意义(t=10.183,P＜0.001),siRNA组小鼠视网膜VEGF蛋白的表达量较模型对照组下调68.0％,差异有统计学意义(t=11.473,P＜0.001),但仍高于正常对照组,差异有统计学意义(t=2.422,P＜0.001).结论 VEGFsiRNA可在体外和体内有效下调视网膜中VEGF的表达,抑制视网膜新生血管的形成.