热休克蛋白B6中和性抗体对脉络膜血管内皮细胞管腔形成的影响及其机制

摘要：背景 血管内皮细胞的增生和迁移是血管发生的主要环节.新近的研究发现,热休克蛋白B6(HspB6)可促进多种与血管新生相关因子的分泌,导致病理状态下新生血管的发生,研究HspB6中和性抗体对人脉络膜血管内皮细胞增生、迁移和管腔形成能力的影响对于脉络膜新生血管相关疾病的靶向治疗具有重要意义. 目的 探讨HspB6中和性抗体对人脉络膜血管内皮细胞管腔形成能力的影响及其机制.方法 对人脉络膜血管内皮细胞株进行培养和传代,取对数生长期细胞用于实验.应用逆转录PCR(RT-PCR)和流式细胞术检测HspB6 mRNA及其蛋白在人脉络膜血管内皮细胞中的表达.将基质胶铺于96孔板中,凝固后加入细胞悬液,细胞密度为2×104个/孔,将不同质量浓度(100 μg/L、500 μg/L)HspB6中和性抗体分别加入培养孔,未加入HspB6中和性抗体的细胞作为对照组(0μg/L HspB6中和性抗体组),每组设3个复孔.细胞孵育12h后,采用体外三维成型法检测各组完整管腔形成的数量,以评价HspB6中和性抗体对人脉络膜血管内皮细胞的管腔形成能力.96孔板培养人脉络膜血管内皮细胞,培养液中加入不同质量浓度(0、50、100、500 μg/L)HspB6中和性抗体孵育24 h,然后采用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)检测细胞的增生值.采用Transwell小室法检测HspB6中和性抗体作用24 h后各组穿过小室膜的“贴壁”细胞数目,以评估人脉络膜内皮细胞的增生和迁移情况.收集HspB6中和性抗体干预后的人脉络膜血管内皮细胞,流式细胞术检测HspB6中和性抗体作用后各组人脉络膜血管内皮细胞的凋亡率. 结果 人脉络膜血管内皮细胞在基因和蛋白水平均可表达HspB6分子.0、100、500 μg/L HspB6中和性抗体组管腔形成数目分别为(67.25±5.75)、(60.39±6.41)和(39.76±10.73)个/视野,总体比较差异有统计学意义(F=10.210,P=0.012),其中500 μg/L HspB6中和性抗体组管腔形成数目明显少于0 μg/L HspB6中和性抗体组,差异有统计学意义(P=0.005).随着HspB6中和性抗体质量浓度的增加和作用时间的延长,其对细胞增生和迁移的抑制率均明显增加,差异均有统计学意义(F质量浓度=7.485,P=0.002;F时间=16.684,P=0.001).Transwell小室法检测显示,0、50、100、500 μg/L HspB6中和性抗体组细胞迁移数目分别为(14.0±2.5)、(11.1±0.8)、(6.6±0.1)、(6.7±0.2)个,其中100 μg/L、500 μg/L HspB6中和性抗体干预24 h后细胞迁移数目较0μg/L HspB6中和性抗体组明显减少,差异均有统计学意义(均P=0.000).流式细胞术检测结果发现,HspB6中和性抗体组人脉络膜血管内皮细胞的凋亡率为(22.73±2.53)％,对照组为(13.33±2.08)％,差异有统计学意义(t=4.967,P=0.008). 结论 HspB6中和性抗体对脉络膜血管内皮细胞的管腔形成有抑制作用,可能通过抑制血管内皮细胞的增生、迁移以及促进细胞的凋亡等途径发挥效应.